Современные крошечные ДНК-чипы, заменяющие целые генетические лаборатории, способны «угадать мелодию», то есть определить ген, всего по нескольким нотам-молекулам. Для того, чтобы это стало возможным, учёным пришлось скрестить полупроводниковые технологии с биохимией.
Молодая калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) — один из лидеров рынка приборов для генетических исследований.
Фирма известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», промышленности и биохимических экспериментов.
ДНК-чипы от Affymetrix широко используются в разных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.
Но обычным людям куда интереснее другой продукт компании. Это прибор, похожий на микросхему, позволяющий идентифицировать десятки ДНК от различных животных в образце человеческой пищи.
bioMerieux FoodExpert-ID фактически — разновидность так называемого GeneChip.
Прибор может идентифицировать биологические следы в пище от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.
Таким образом, он позволяет узнать, действительно ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.
ДНК-чип создаётся по технологиям, сходным с компьютерными, но это не электронный, а биологический объект (иллюстрация с сайта affymetrix.com).
А, к примеру, мусульмане могут проверить — не положили ли недобросовестные изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.
Всё это, правда, работает, лишь с привлечением дополнительных лабораторных возможностей, так что использовать чип в «голом» виде, на коленке, простому потребителю не удастся.
Чтобы понять, как работает FoodExpert-ID, нужно вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания — аденин, гуанин, тимин и цитозин, а также то, что они могут соединяться только попарно, словно ключи и замки.
ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.
Фрагмент поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с сайта affymetrix.com).
Поверхность чипа размером с ноготь разделена на 97 тысяч квадратиков, названных «особенностями».
Каждая «особенность» поперечником приблизительно 26 микронов содержит лишь один ДНК-код. Точнее много-много одинаковых молекул.
И все они однозначно относятся к одному из 33 животных.
Длина каждого фрагмента — 17 оснований. Этого достаточно для надёжной идентификации, как достаточно 17 взятых подряд в любом месте нот, чтобы определить какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.
Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из образца пищи. Чего там только нет. А чего?
«Неправильные» фрагменты генетических кодов смываются, а совпадающие — закрепляются на чипе. Красные шарики — флуоресцентные молекулы (иллюстрация с сайта affymetrix.com).
Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать немного.
Все совпадающие фрагменты кода соединятся со своими «родными» последовательностями в той или иной «особенности».
Теперь чип можно промыть водой — всё лишнее уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко светиться. Осталось лишь свериться с картой чипа, чтобы узнать — какие ДНК определены.
А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетической котлете.
Как видим, использование чипа сравнительно несложно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим весьма простой набор оборудования.
Но насколько же хитроумно производство чипа. Чтобы создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.
Цветные квадратики — «особенности», отвечающие за идентификацию того или иного ДНК-кода (иллюстрация с сайта affymetrix.com).
Исходный продукт — кварцевая пластина — покрывается специальным реактивом, силаном, который прочно соединяется с кварцем и формирует строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.
В цепочках будущего кода основания идут вертикально вверх, а наносят их одновременно на всю поверхность, слой за слоем.
Разумеется, каждый раз на чип подают определённое вещество, и чтобы оно закрепилось только в определённых «особенностях», тех самых микронных квадратиках, используют маски, аналогичные тем, что нужны для производства микросхем.
Снимок прореагировавшего чипа с большим увеличением. Белые, красные, жёлтые квадратики — участки с высокой концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, синие, чёрные — соответственно, со всё более и более с низкой (иллюстрация с сайта affymetrix.com).
С основой чипа каждый раз сцепляются лишь те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.
В этом процессе последовательного синтеза главное — каждый раз накладывать новую маску с микронной точностью, иначе все генетические коды на пластине перемешаются.
Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях фирмы — до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и создают ключи-анализаторы генов.
Эта технология служит, конечно, не только для таких забавных (на первый, возможно, взгляд) областей применения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, но и для вполне серьёзных научных исследований.
Ведь на поверхность чипа, теоретически, можно нанести фрагменты каких угодно генетических кодов.
Работа Affymetrix — лишнее доказательство, что самые интересные и перспективные открытия происходят на стыках наук и дисциплин.
Похоже на биологическое разнообразие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?
ДНК-микрочипы
ДНК-чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК-чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.
Впервые ДНК-чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века . В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.
ДНК-чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие - 15-25 нуклеотидов, длинные - 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты - от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото . Наиболее распространенные подложки - из стекла.
Белковые и пептидные чипы
Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции.Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов - РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток - ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97 . Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами - природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др.
Современная генетика шагнула глубоко за пределы представлений прошлого. Нынешняя наука способна формировать базы знаний на генном уровне. Генетические чипы, о которых пойдет речь в настоящей статье, способны определять признаки мутационных процессов в клетках и полиморфизм определенного гена.
1. Описание
ДНК чипы – это так называемая технология определения параметров и характеристик определенного гена, а также его свойства и эволюции.
Технология микрочипов используется в молекулярных разделах генетики и биологии. В исследованиях используются микрочипы, которые состоят из более тысячи так называемых зондов (научное название — дезоксирибонуклеотид).
ДНК зонды состоят из группы микроточек, которые закрепляются на подложке. Микроточка состоит из пико молей, образованных из цепочек нуклеотидов.
Метод гибридизации используется для определения количества и регистрации элементов молекулы гена. При этом используется флуоресцентный способ обработки данных. Этот способ определяет численность нуклеотидов заданной спирали.
2. История
Исследованиями генетической наследственности человеческого организма ученые занимаются более двух столетий. Хотя первые
ДНК чипы
результаты экспериментов и выдвигаемые теории были даны в начале двадцатого века
В 53 году двадцатого века экспериментально доказано, что в структуре белка участвуют уникальные последовательности аминокислот, которые выстроены в спиралевидную лестницу.
Разработка микрочипов была выделена из методики Саузерн-блоттинг. Эта методика состояла в том, что фрагменты генетического кадрирования переносили на твердый носитель и впоследствии с его помощью определяли последовательности нуклеотидов, которые содержатся в этом образце.
В 1987 году генетический шифр впервые был объединен в чип. В этом же году были поставлены первые эксперименты об определении экспрессий геномов в регуляции. Первые опыты проводились с помощью интерферонов молекулы.
Ранее вместо твердой поверхности использовалась фильтрованная бумага, на которую наносилось микроскопическое количество ДНК с помощью метода раскапывания.
Впервые мини-чипы использовались в 1995 году для определения экспрессии генома.
В 1997 году генетики поставили опыт, в котором безраздельный эукариотический ген находился на ДНК-чипе.
3. Принцип действия
В качестве подложки чипа используются твердые поверхности, выполненные из стекла и кремния. Существуют также миниатюрные шарики, которые используются для крепления зондов. Шарики в основном выпускает компания Illumina.
Технологии микро-кодирования отличаются следующими параметрами:
· Характеристика работы;
· Конструкция;
· Точность;
· Эффективность;
· Стоимость.
По типам ДНК зонды различаются на четыре основных вида:
· Printed – зонды изготавливаются химическим способом, после чего прилепляются к подложке. Зонд наносится иглой в определенные точки либо используется принтер (чернила обычного струйного принтера заменены на капельки нанолитрового объема).
· In-situ – способ нанесения фотолитография. Использование ультрафиолетового света для нанесения групповых нуклеотидов. Для одной группы нуклеотидов необходимо четыре раза сменить фотолитографическую маску. Первая применяется для синтезирования нуклеотидов, три оставшиеся для предотвращения защитного снятия. Один чип генетического кода составлен из ста фотолитографических масок.
· High-density – использование цветного кодирования бусинок из кварца. Бусинки распределяются случайным образом на стекле из кварца, собранного в подложку. При таком типе диагностики в одном квадратном миллиметре может быть собранно более сорока тысяч элементов.
· Bead Array – метод декодирования шариков из стекла. Каждому шарику подложки присвоен определенный адрес, который состоит из трех возможных значений последовательности.
4. Для чего необходимо
Использование технологий микроэлементов генетического кода позволяет оценить состояние и идентификацию генов живого организма. С помощью чипов возможно безраздельное и комплексное исследование биологического организма.
5. Использование в медицине и генетике
Генетика и биологическая медицина использует практические и теоретические результаты микрочипов генетического кода. Регулярно проводятся исследования для анализа экспрессии генов, благодаря чипам. При этом выявляется информация четырех направлений:
· Одно нуклеотид;
· Полиморфизм;
· Генотипирование;
· Сегментирование мутированных геномов.
Технология является эффективной при синтетическом анализе идентификации большого числа генов. При этом одновременно производиться структурный анализ, для каждого взятого нуклеотида и их последовательностях.
6. Перспективы развития
Распространенное использование этой технологии в генетики и молекулярной биологии связано с несколькими параметрами, которыми обладают современные чипы:
· Очень высокая чувствительность;
· Специфичность технологии;
· Воспроизводство экспериментальных результатов;
· Простота реализации процедур;
· Возможная реализация одновременной информации с большого количества параметров;
· Невысокая стоимость затрат.
7. Познавательные факты
В настоящее время существуют два метода традиционной диагностики, обладающие следующими характеристиками:
· Реальное время:
· Оценка численности матрицы в основании;
· Нет, труднодостижимых работ;
· Нет, этапа электрофореза, малый риск ложных результатов;
· Полученные результаты анализируются математически;
· Минимальные требования к организации лаборатории;
· Существенная экономия времени.
· Биологические чипы:
· Миниатюрные образцы;
· Маленькие затраты на работу;
· Экономия времени;
· Серийный анализ характеристик;
· Чувствительность метода;
· Простота выполнения.
Вероятно, объединив два метода диагностики можно сформировать абсолютно уникальный вид технологического анализа, который эффективно справиться со всеми задачами будущего и современности.
ДНК-микрочип - это как правило небольшая отполированная кремниевая пластина, на поверхности которой закреплены специальные ДНК-зонды. Именно зонды отвечают за распознавание ДНК. Зонд - это небольшой искусственно синтезированный участок ДНК, который нацелен на выявление одной единственной мутации. На чипах разных производителей от нескольких сотен до нескольких миллионов зондов, и каждый представляет уникальную мутацию.
Перед анализом на чипе ДНК выделяют, например, из слюны, очищают от посторонних веществ и нарезают на небольшие фрагменты.
Затем раствор с этими фрагментами наносят на чип и оставляют на время. Эта стадия называется инкубацией. В течение этого времени фрагменты исследуемой ДНК проникают между зондами на чипе, и далее процесс может пойти по двум путям. В одном случае, если последовательность фрагмента ДНК зеркальна (комплементарна) по отношению к последовательности ДНК зонда, произойдет слипание (гибридизация), потому что комплементарные участки ДНК подходят друг к другу как края застежки-молнии. Если же фрагмент похож на зонд лишь отчасти или не похож вообще, гибридизации не произойдет и он продолжит свободно плавать между зондами.
После инкубации наступает стадия отмывки, призванная удалить несвязанные фрагменты с чипа. При этом удаляются не только свободные фрагменты, но и те, которые загибридизовались лишь частично. Если гибридизация происходит частично, значит фрагмент не полностью подошел в зонду и его нужно убрать. Полностью комплементарные фрагменты ДНК настолько хорошо держатся за зонд, что не смываются на этой стадии.
После отмывки на чипе остаются зонды, связанные с участками ДНК человека, и свободные зонды.
На финальной стадии происходит выявление тех зондов, с которыми связались фрагменты исследуемой ДНК. Здесь подходы различаются. Например, на чип наносится специальная светящаяся метка, которая прочно соединяется только со "сработавшими" зондами. Несвязанные метки снова отмываются, а затем чип фотографируется под микроскопом. Получается сетка из множества разноцветных точек с разной яркостью. Зная, в какой точке какой зонд расположен, можно понять, какие именно последовательности ДНК есть у человека, то есть какими мутациями он обладает.
Исследуемую ДНК нарезают специальными ферментами, рестриктазами, которые распознают в последовательности нуклеотидов особые сочетания и режут по ним. Эти особые сочетания нуклеотидов разбросаны по ДНК достаточно равномерно, поэтому фрагменты получаются достаточно однородными по длине.
Равномерность нанесения на чип достигается тем, что фрагменты наносятся в виде раствора. А в нем уже тепловое (броуновское) движение распределяет моелкулы равномерно. Остается нанести каплю раствора на на то место чипа, где находятся зонды. А это не сложно - обычно такое окно на чипе имеет размеры не более 10х10 мм.
Ответить
Прокомментировать
